Mutationsanalysen, Promotoranalysen und funktionelle Studien an Kandidatengenen für Morbus Parkinson

• Mutationsanalyse Synphilin-1:
  Synphilin-1 ist als Interaktionspartner von a-Synuclein (PARK1) und Parkin (PARK2) mit der Pathogenese von Morbus Parkinson verknüpft. Darüber hinaus ist Synphilin-1 ein Bestandteil der Lewy-Körper in den Gehirnen von Patienten mit sporadischem Morbus Parkinson. Deshalb haben wir eine detaillierte Mutationsanalyse des Synphilin-1 Gens in 328 deutschen Parkinson Patienten mit familiärem und sporadischem Morbus Parkinson durchgeführt. In zwei Parkinson-Patienten wurde eine neue C>T Transition an Position 1861 der codierenden Sequenz identifiziert, die zu einem Aminosäureaustausch von Arginin nach Cystein an Position 621 führt (R621>C). Diese Mutation wurde in keiner der 351 gesunden Kontrollpersonen gefunden. Um eine mögliche Rolle von mutiertem Synphilin-1 an der Pathogenese von Morbus Parkinson zu untersuchen, haben wir funktionelle Analysen in SH-SY5Y Zellen durchgeführt. Dabei hat sich herausgestellt, dass Synphilin-1 in transfektierten Zellen cytoplasmatische Einschlüsse bildet. Dabei wurden bei Hemmung von Proteasomen signifikant weniger Einschlüsse in C621 Synphilin-1 exprimierenden als in Wildtyp-Synphilin-1 exprimierenden Zellen beobachtet. Mit C621 Synphilin-1 transfektierte Zellen waren darüber hinaus mehr anfällig gegenüber Staurosporin-induziertem Zelltod. Diese Ergebnisse sprechen für eine kausale Rolle der R621>C Mutation im Synphilin-1 Gen beim Morbus Parkinson und impliziert, dass die Entstehung intrazellulärer Einschlüsse positive Effekte für Zellen hat. Die Mutation in Synphilin-1 reduziert die Aggregatikonsfähigkeit und könnte Neurone anfälliger gegenüber zellulären Stress machen.

• α-Synuclein Promotor:
  Mutationen im a-Synuclein Gen haben sich in einigen Familien als verantwortlich für autosomal dominant vererbten Morbus Parkinson erwiesen. Außerdem ist a-Synuclein eine Hauptkomponente der Lewy Körper in der sporadischen Form von Morbus Parkinson. Erhöhte Konzentrationen von Wildtyp a-Synuclein führen zu erhöhten intrazellulären Wasserstoffperoxid-Konzentrationen und verursachen den Untergang dopaminerger Neurone in Ratten-Primärkulturen. Nachfolgend wurde in vitro ein direkter Zusammenhang von oxidativem Stress mit a-Synuclein-Aggregation nachgewiesen. Es stellt sich also die Frage, ob eine erhöhte Expression von a-Synuclein auch ein erhöhtes Erkrankungsrisiko für Morbus Parkinson bewirkt und ob Promotorpolymorphismen im a-Synuclein Gen mit Morbus Parkinson assoziiert sind. Wir haben zwei Polymorphismen des a-Synuclein Promotors (-116C>G and -668T>C) in 315 deutschen Parkinson-Patienten charakterisiert. Der Einfluss der 4 Haplotypen auf die Genexpression wurde mittels CAT-Reportergenanalysen in neuronalen SK-N-AS Zellen untersucht. Der -668C/-116G Haplotyp ergab eine signifikant höhere CAT-Expression als der 668T/-116G oder der -668T/-116C Haplotyp. In Parkinson-Patienten kommt der -668C/-116G Haplotyp häufiger als die übrigen Haplotypen, jedoch war dieser Unterschied nicht signifikant.

• Mutationsanalyse NF-L:
  Mutationen in zwei Genen, a-Synuclein (SNCA) und Parkin, wurden als Ursache in einigen Fällen familiärer der Parkinsonschen Erkrankung identifiziert. Nachfolgend wurden a-Synuclein und Parkin in Lewy-Körpern nachgewiesen. Um weitere Einblicke in die Pathogenese der Morbus Parkinson zu erhalten, wurde die Beteiligung des Neurofilament Light-Gens (NF-L) in deutschen Patienten mit Morbus Parkinson untersucht. NF-L ist ebenfalls eine Komponente der Lewy-Körper. Eine detaillierte Mutationssuche in 328 sporadischen und familiären deutschen Parkinson-Patienten ergab drei stille Basenaustausche (G163A, C224T, C487T) in drei unverwandten Patienten. Die Analyse der Promotorregion des NF-L Gens lieferte drei Basenpaaraustausche, die 5 Haplotypen bilden. Assoziationsstudien dieser Haplotypen ergaben keine signifikanten Unterschiede zwischen Parkinson-Patienten und 344 Kontrollindividuen. Deshalb ist NF-L wahrscheinlich nicht hauptsächlich an der Pathogenese von Morbus Parkinson beteiligt.

• Mutationsanalyse 14-3-3 eta:
  Mutationen im a-Synuclein Gen wurden in einigen Familien mit autosomal dominantem Morbus Parkinson identifiziert. a-Synuclein besitzt strukturelle und funktionelle Homologien zu 14-3-3 Proteinen und bindet sowohl 14-3-3 Proteine als auch deren Liganden. Deshalb wurde untersucht, ob 14-3-3 Proteine ebenfalls an der Pathogenese von Morbus Parkinson beteiligt sind. Wir konnten zeigen, dass 14-3-3 Proteine ebenfalls Bestandteil der Lewy-Körper sind. Das 14-3-3 eta Gen (YWHAH) liegt auf Chromosom 22q12.1-q13.1, eine Region, die mit Morbus Parkinson in Verbindung gebracht wurde. Deshalb wurde 14-3-3 eta mittels Mutationsanalysen und Assoziationsstudien untersucht. In 358 sporadischen und familiären Parkinson Patienten wurden jedoch keine krankheitsverursachenden Mutationen identifiziert. Außerdem lieferten Assoziationsstudien mit intragenischen Polymorphismen keine Beweise für eine Beteiligung von 14-3-3 eta an der Pathogenese von Morbus Parkinson.

• Mutationsanalyse 14-3-3 zeta:
  14-3-3 Proteine sind an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt, darunter auch die neuronale Entwicklung und die zelluläre Wachstumskontrolle. 14-3-3 Proteine sind besonders stark im Gehirn konzentriert, wo sie ca. 1% der löslichen Proteine ausmachen. Sie wurden sowohl in den neurofibrillären Tangles von Alzheimer-Patienten als auch in den Lewy Körpern von Parkinson-Patienten nachgewiesen. Als Kinase-abhängige Aktivatoren der Tyrosin- und Tryptophan Hydroxylasen sind sie an der Synthese und Exkretion von Bioaminen wie Dopamin beteiligt. Kürzlich wurde gezeigt, dass a-Synuclein strukturelle und funktionelle Homologien zu 14-3-3 Proteinen besitzt und sowohl 14-3-3 Proteine als auch deren Liganden bindet. Im a-Synuclein Gen wurden bei einigen Familien mit autosomal dominant vererbten Morbus Parkinson Mutationen identifiziert. Deshalb haben wir untersucht, ob 14-3-3 Proteine ebenfalls an der Pathogenese von Morbus Parkinson beteiligt sind. Wir haben dazu mittels SSCP-Analyse nach Mutationen im 14-3-3 zeta Gen (YWHAZ) auf Chr. 8q23.1 und zwei homologen Genen auf den Chromosomen 10p12.33 (XM_005100) and Xp11.4 (XM_018019.2) gesucht. In 460 sporadischen und familiären deutschen Parkinson-Patienten wurde keine Mutation im 14-3-3 zeta Gen identifiziert, aber die Analyse des homologen Gens auf Chromosom X ergab in einem Patienten eine A95>G Transition, die zu einem Gln32>Arg Austausch führt. Da keine Familienmitglieder verfügbar sind, sind funktionelle Analysen notwendig, um die Bedeutung dieser Mutation bei der Pathogenese von Morbus Parkinson zu untersuchen. In einem weiteren Patienten wurde eine 1 bp Deletion (98delG) im homologen Gen auf Chr. 10 identifiziert. Eine Tochter des Indexpatienten trägt ebenfalls diese Mutation, hat aber das Erkrankungsalter des Indexpatienten noch nicht erreicht, so dass auch für diese Mutation funktionelle Analysen notwendig sind. Beide Mutationen wurden in keiner von 364 Kontrollpersonen gefunden.

Tiermodelle neurodegenerativer Erkrankungen

• Morbus Huntington ist eine neurodegenerative CAG-Trinukleotidexpansionserkrankung des Menschen. Wir haben ein transgenes Rattenmodell entwickelt, das ein verkürztes Huntingtin-Gen mit 51 CAG-Wiederholungseinheiten unter der Kontrolle des nativen Huntingtin-Promotors der Ratte exprimiert. Wie bei der humanen Erkrankung beginnt der neurologische Phänotyp bei adulten Ratten und schreitet langsam fort. Die Tiere zeigen Symptome wie reduziertes Angstverhalten, kognitive Beeinträchtigungen, fortschreitende motorische Fehlfunktionen und die typischen histopathologischen Veränderungen im Gehirn. Wie bei den Morbus Huntington Patienten, zeigten in vivo bildgebende Verfahren eine Schrumpfung des Striatums (MRT) und einen reduzierten Zuckerstoffwechsel (hochauflösende Fluor-deoxy-Glucose PET). Dies ist das erste Ratten-Modell einer neurodegenerativen Erkrankung, das eine intermediäre Zahl an CAG-Wiederholungen exprimiert. Das Modell erlaubt ausgedehnte in vivo bildgebende Untersuchungen und ist deshalb ideal für die Evaluierung neuer therapeutischer Ansätze für Morbus Huntington.

• konditionell transgene Mäuse, die über das Tet-Off-System die konditionelle Expression des SCA3-Gens erlauben und somit ein induzierbares Modell für die Machado-Joseph-Erkrankung (bzw. Spinocerebellare Ataxie Typ 3) bilden. Das Modell wurde bereits auf internationalen Tagungen vorgestellt und wird gegenwärtig charakterisiert.

• konditionell transgene Mäuse, die über das Tet-Off-System die konditionelle Expression des α-Synuclein-Gens (WT und Ala30Pro) ermöglichen und somit ein induzierbares Modell für den Morbus Parkinson bilden. Das Modell wurde bereits auf internationalen Tagungen präsentiert und auf dem 3. Deutschen Parkinson-Kongress in Dresden mit einem Posterpreis ausgezeichnet.

Förderung

durch die Medizinische Fakultät der Universität Rostock:

• Forun 2000: Anschubförderung "Bedeutung von Sequenzvarianten des α-Synuclein Promotors bei der Pathogenese des Morbus Parkinson"
  19.800,- DM Sachmittel (Geräte und Verbrauchsmaterial)
• Forun 2001: Verlängerung der Anschubförderung "Bedeutung von Sequenzvarianten des α-Synuclein Promotors bei der Pathogenese des Morbus Parkinson"
  10.000,- DM Sachmittel (Verbrauchsmaterial)
• Forun 2002-2003: Anschubförderung "Bedeutung von Sequenzvarianten von 14-3-3 Proteinen bei der Pathogenese des Morbus Parkinson"
  15.000,- EUR Sachmittel (Geräte und Verbrauchsmaterial) für 2002
  10.000,- EUR Sachmittel (Verbrauchsmaterial) für 2003
• Forun 2007: Projektförderung "Transgenes Rattenmodell für Morbus Huntington: striatale Transplantation von humanen CNTF oder CIP-4 exprimierenden neuronalen Progenitorzellen"
  30.000,- EUR Fördervolumen (Geräte und Verbrauchsmaterial)
• Forun 2008-2009 Projektförderung "Untersuchung des Zusammenhangs von Proteolyse und Pathogenese beim transgenen Rattenmodell für Morbus Huntington"
  44.730,- EUR Fördervolumen (Personalmittel und Verbrauchsmaterial)

Publikationsliste

Reprints oder PDF-Files auf Anfrage

• Mosbacher, S., Holzmann, C., Hermann, K., Urano, F., Ichinose, H., Schwarz, N., Peschel, T., Müller, T., Schöls, L., Krüger, R., Ichimura, T.& and Riess, O. Characterization of mutations in 14-3-3zeta homologous genes and their role in Parkinson's disease. Journal of Neurogenetics under rewiew

• Nguyen HP, Metzger S, Holzmann C, Koczan D, von Hoersten S, Riess O and Bonin M (2008) Age-dependent gene expression profile and protein expression in a transgenic rat model of Huntington’s disease. Proteomics Clin. Appl. 2:1638

• S. Nuber, E. Petrasch-Parwez, B. Winner, J. Winkler, S.v.Hörsten, Th. Schmidt, J. Boy, M. Kuhn, H.P.Nguyen, P.Teismann, JB Schulz, M.Neumann, B.J.Pichler, G.Reischl, C.Holzmann, I.Schmitt, A.Bornemann, W.Kuhn, F.Zimmerman, S.B.Prusiner, A. Servadio and O. Riess (2008) Neurodegeneration and Motor Dysfunction in a Conditional Model of Parkinson’s Disease. J Neurosci 28:2471

• Nguyen HP, Kobbe P, Rahne H, Worpel T, Jager B, Stephan M, Pabst R, Holzmann C, Riess O, Korr H, Kantor O, Petrasch-Parwez E, Wetzel R, Osmand A, and von Hörsten (2006) Behavioral abnormalities precede neuropathological markers in rats transgenic for Huntington's Disease. Hum Mol Genet, 15, 3177-3194

• Boy J, Leergaard TB, Schmidt T, Odeh F, Bichelmeier U, Nuber S, Holzmann C, Wree A, Prusiner SB, Bujard H, Riess O, and Bjaalie JG (2006) Expression mapping of tetracycline-responsive prion protein promoter: Digital atlasing for generating cell-specific disease models. Neuroimage, 33, 449-462.

• Kántor, O., Temel, Y., Holzmann, C., Krotova, J., Cao, C., Türkoglu, H.Ö., Rutten, B.P.F., Visser-Vandewalle, V., Steinbusch, H.W.M., Blokland, A., Korr, H., Riess, O., von Hörsten, S., Schmitz, C. (2006)
  Selective striatal neuron loss and alterations in behavior in line with impaired striatal activity in Huntington's disease transgenic rats
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• Bauer, A, Zilles, K., Matusch, A., Holzmann, C., Riess, O. and von Hörsten, S. (2005)
  Regional and subtype selective changes of neurotransmitter receptor density in a rat transgenic for the Huntington's disease mutation
  Journal of Neurochemistry 94:639-650

• Hering, R., Petrovic, S., Mietz, E.-M., Holzmann, C., Berg, D., Bauer, P., Woitalla, D., Müller, T., Berger, K., Krüger, R., and Riess, O. (2004)
  Extended mutation analysis and association studies of Nurr1 (NR4A2) in Parkinson's Disease
  Neurology 62:1231-1232

• Berg, D., Holzmann, C. and Riess, O. (2003)
  14-3-3 proteins in the nervous system.
  Nature Reviews Neuroscience 4:752-762

• Marx F.P., Holzmann C., Strauss K.M., Li L., Eberhardt, O., Gerhardt, E., Cookson M., Hernandez , D.,Farrer M.J., Kachergus, J., Engelender, S., Ross, C.A., Berger, K., Schols, L., Schulz J.B., Riess O., Krüger R. (2003)
  Identification and functional characterization of a novel R621C mutation in the synphilin-1 gene in Parkinson's disease
  Human Molecular Genetics 12:1223-1231

• Von Hörsten, S., Schmitt, I., Nguyen, H.P., Holzmann, C., Schmidt, T., Walther, T., Bader, M., Pabst, R., Kobbe, P., Stiller, D., Kask, A., Vaarmann, A., Rathke-Hartlieb, S., Schulz, J.B., Grasshoff, U., Bauer, I., Vieira Menezes Saecker, A.M., Paul, M., Jones, L., Lindenberg, K.S., Landwehrmeyer, B., Bauer, A., Li, X.-J. and Riess, O. (2003)
  Transgenic rat model of Huntington's disease
  Human Molecular Genetics 12:617-624

• Holzmann, C., Krüger, R., Menezes Saecker, A.M., Schmitt, I., Schöls, L., Berger, K. and Riess, O. (2003)
  Polymorphisms of the alpha-synuclein promoter: Expression analyses and association studies in Parkinson's disease
  Journal of Neural Transmission 110: 67-76

• Ubl, A. Berg, D., Holzmann, C., Krüger, R., Berger, K., Arzberger, T. and Riess, O. (2002)
  14-3-3 protein is a component of Lewy bodies in Parkinson's disease - Mutation analysis and association studies of 14-3-3 eta
  Brain Res Mol Brain Res. 2002 Dec 16;108(1-2):33-9.

• Rahner, N., Holzmann, C., Krüger, R., Schöls, L. and Riess, R. (2002)
  The neurofilament L gene is not a genetic factor of sporadic and familial Parkinson's disease
  Brain Research 951:82-86

• Holzmann, C., Schmidt, T., Thiel, G., Epplen, J.T. and Riess, O. (2001)
  Functional characterization of the human Huntingtin promoter
  Molecular Brain Research 92: 85-97

• Holzmann, C. (1998)
  Isolierung und Charakterisierung des Promotors des Huntingtin-Gens.
  Dissertation an der Ruhr-Universität Bochum, Fakultät für Biologie

• Holzmann, C., Mäueler, W., Petersohn, D., Schmidt, T., Thiel, G., Epplen, J.T. and Riess, O. (1998)
  Isolation and characterization of the rat Huntingtin promoter.
  Biochem. J. 336: 227-234

• Holzmann, C., Menezes Vieira Saecker, A.M., Epplen, J.T. and Riess, O. (1997)
  Avoiding errors in the diagnosis of (CAG)n expansion in the huntingtin gene.
  J. Med. Genet. 34: 264